MALDI-TOF – Identificação Microbiana em Hemoculturas

22.05.2014

A tecnologia MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight) está sendo implementada no Laboratório Richet como uma sólida e rápida metodologia de identificação de microrganismos no setor de Microbiologia Clínica.

Os métodos microbiológicos tradicionais de identificação da maioria dos agentes infecciosos baseiam - se na análise fenotípica do metabolismo de provas bioquímicas dos microrganismos. Mesmo através da utilização de sistemas automatizados, o resultado final da identificação do agente etiológico das infecções leva, em muitos casos, entre 12 e 24 horas, podendo chegar a dias em algumas situações específicas. Muitas vezes os resultados, quando obtidos, perdem impacto clínico e atrasam a correta terapia antimicrobiana no tratamento do paciente.

A técnica de MALDI-TOF baseia-se na analise e detecção de um grande espectro de proteínas, que é capaz de discriminar espécies estreitamente relacionadas. Conhecida como espectrometria de massa – foi primeiramente utilizada para a identificação de bactérias em 1975, sem, entretanto, ter entrado na rotina da microbiologia clínica. Com o tempo, a técnica permitiu a detecção de moléculas de maior massa – como, por exemplo, as proteínas. A evolução ocorreu quando a matriz utilizada para ionizar as proteínas foi mudada para que pudesse ionizar as proteínas ribossomais – estas bem mais conservadas do que as proteínas de superfície – o que levou à identificação de espécies e até subespécies de muitos microrganismos.

Inúmeros estudos foram desenvolvidos nos últimos anos demonstrando a efetividade da técnica MALDI-TOF na rápida identificação bacteriana e fúngica. Outros protocolos foram desenvolvidos para identificar patógenos presentes em hemoculturas, a partir da aplicação da espectrometria de massa diretamente dos frascos de hemoculturas dos sistemas automatizados, quando detectados positivos.
Há ainda o desenvolvimento de estudos proteômicos para a identificação de fenótipos de mecanismos de resistência.

No sistema MALDI-TOF os microrganismos são colocados em uma placa que contém uma matriz polimérica. A placa é irradiada com um laser que vaporiza a amostra ionizando as moléculas que serão aspiradas e elevadas a um detector. Dependendo da molécula, o tempo de chegada será diferente (time of flight). Os dados obtidos através de gráficos que representam estas leituras serão comparados a uma base algorítmica que contém um grande número de espécies de relevância clínica – incluindo microrganismos aeróbios, anaeróbios, micobactérias, leveduras e fungos filamentosos. O procedimento é muito rápido e os resultados são obtidos em minutos.

A aplicação da espectrometria de massa através da técnica de MALDI-TOF à microbiologia clínica é inegável. Trata-se de uma ferramenta simples, rápida e altamente confiável, que substitui os métodos fenotípicos convencionais para a identificação bacteriana e fúngica na rotina do laboratório clínico, minimizando o tempo para a realização de diagnósticos fundamentais e otimizando a terapia antimicrobiana.

Com a utilização da técnica MALDI-TOF já é possível à obtenção da identificação de microrganismos diretamente das garrafas de hemocultura. Ou seja, a partir do momento em que haja a sinalização de positividade na amostra, já é possível obter a identificação de gênero e espécie na maioria dos casos, em cerca de 30 minutos. Esta nova implementação permite o ganho de cerca de 12 a 48 horas na liberação dos resultados de hemocultura, sendo de fundamental importância para o tratamento dos casos de sepse.

Referências Bibliográficas:

Bizzini, A., C. Durussel, J. Bille, G. Greub, and G. Prod’hom. 2010. Performance of matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry for identification of bacterial strains routinely isolated in a clinical microbiology laboratory. J. Clin. Microbiol. 48:1549–1554

Degand N, Carbonnelle E, Dauphin B, et al.: Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry for identification of nonfermenting gram-negative bacilli isolated from    cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol 2008, 46:336

Edwards-Jones V, Claydon M, Evason D et al. Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus

 aureus by intact cell mass spectrometry. J Med Microbiol 2000; 49: 295–300.

Ferroni A, Suarez S, Beretti J-L, Dauphin B, Bille E, Meyer J,Bougnoux     M-E, Alanio A, Berche P, Nassif X (2010) Real-time identification of bacteria and Candida species in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 48(5):1542–1548

Hettick, J. M., et al. 2006. Discrimination of intact mycobacteria at the strain level: a combined MALDI-TOF MS and biostatistical analysis. Proteomics 6:6416–6425.

Hettick JM, Green BJ, Buskirk AD, et al.: Discrimination of Aspergillus isolates at the species and strain level by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting. Anal Biochem 2008, 380:276–281.

Mellmann, A., J. Cloud, T. Maier, U. Keckevoet, I. Ramminger, P. Iwen, J.Dunn, G. Hall, D. Wilson, P. Lasala, M. Kostrzewa, and D. Harmsen. 2008. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J. Clin. Microbiol. 46:1946–1954

Stevenson, L. G., S. K. Drake, Y. R. Shea, A. M. Zelazny, and P. R. Murray. 2010. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of clinically important yeast species. J. Clin. Microbiol. 48:3482–3486.

Stevenson, L. G., S. K. Drake, and P. R. Murray. 2010. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 48:4444

Veloo ACM, Knoester M, Degener JE, Kuijper EJ (2011) Comparison of two matrix-associated laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods for the identification of clinically relevant anaerobic bacteria. Clin Microbiol Infect 17(10):1501–1506

Baixe o artigo aqui