Testes laboratoriais para o diagnóstico de COVID-19 – Atualizações

15.07.2020

Com a evolução da pandemia causada pela Covid-19, os testes diagnósticos também evoluíram consideravelmente, tanto para o diagnóstico de infecção ativa, como os testes moleculares de RT-PCR, quanto para a pesquisa de imunidade adquirida ou diagnóstico complementar através de anticorpos séricos.

Na parte de testes de RT-PCR, as novidades ficam por conta dos testes mais rápidos e também da maior capacidade de produção através de novas metodologias. Uma das novidades fica por conta do teste Xpert Xpress (Cepheid, EUA), realizado no equipamento GeneXpert, o mesmo que já era utilizado para outros testes moleculares rápidos como a pesquisa de M. tuberculosis, Influenza vírus e Clostridium difficile, dentre outros. Para quem ainda não está familiarizado com este tipo de teste, ele é todo realizado dentro de uma espécie de cartucho aonde ocorre todo o processo de amplificação por RT-PCR, através de um equipamento que coordena toda a parte mecânica do teste e análise dos resultados. Após concluído, o cartucho é descartado. O resultado é disponibilizado em até 24h da realização do exame. São utilizados 2 genes alvos, gene E e gene N. O gene E é comum ao SARS-Cov e o gene N é específico para o SARS-CoV-2.

A grande maioria dos estudos disponíveis sobre a performance, mostram que o grau de sensibilidade é semelhante ao dos testes convencionais (tab.1). As indicações incluem pacientes que precisam fazer procedimentos hospitalares de emergência em ambiente seguro, e pacientes de maior risco ou com quadro clínico que requer maior cuidado e precisa do diagnóstico com urgência.

Tabela 1. Relação de estudos comparativos entre Xpert Xpress SARS-CoV-2 e outras metodologias.

PPA: Positive Percentual Agreement; NPA: Negative Percentual Agreement; LOD: Limit Of Detection.

 

No processo de validação interna do teste, comparamos o GeneXpert SARS-CoV-2 com um teste de RT-PCR tradicional, utilizando plataforma automatizada, Allplex 2019-nCov, Seegene (Coreia do Sul), entre 10 amostras, sendo 5 positivas e 5 negativas, obtendo PPA e NPA de 100% para ambos.

Das 5 amostras positivas, 2 tinham CT alto, correspondendo a baixa carga viral (37,62 para o gene RdRp e 39,29 para gene N). Em seguida foi feito um pool de amostras positivas e feito diluições seriadas, cujos resultados foram concordantes até a diluição de 1:10.000), comprovando PPA de 100% e sensibilidade semelhante entre as duas técnicas, mesmo em amostras diluídas.

Testes para Pesquisa de Anticorpos

Em relação aos testes para pesquisa de anticorpos, houve também grande evolução, principalmente com a disponibilização de novos testes, principalmente em plataformas automatizadas, que permitem maior segurança e rapidez na entrega dos resultados. Os principais podem ser listados, como Abbott Arquitect IgG, EUA (N), Ortho Vitros IgG, EUA (S), Diasorin Liaison IgG, Itália (S1/S2) e Roche Cobas Total (N), Suíça; além dos que já vinham sendo utilizados como Euroimmun (Alemanha) IgG, IgA (S), IgG NCP (N) e Snibe Maglumi (China) IgG e IgM. O que existe de diferença nos testes, além da sensibilidade e especificidade analítica é o substrato utilizado como antígeno para a captura de anticorpos, mas, segundo a grande maioria dos estudos o maior grau de sensibilidade é obtivo após a 3a semana após o início da sintomatologia em todos os testes.

O vírus SARS-Cov-2 apresenta uma cadeia simples de RNA, que está estreitamente relacionado ao SARS-CoV e outros membros da linhagem B do genogrupo dos coronavírus, como o OC43, HKU1, 229E e NL63. O RNA do coronavírus codifica para quatro categorias principais de proteínas estruturais: Membrana (M), Envelope (E), Nucleocapsidio (N) e Spike (S). A proteína N, que induz à imunidade mediada pelos linfócitos CD8+, é amplamente utilizada como antígeno para a captura de anticorpos nos testes reagentes, por ser de fácil manipulação e apresentar bom grau de especificidade. Já a proteína S, está intrinsicamente ligada à ação viral, pois é uma proteína de fusão viral, que desempenha papel crucial na infecção, ao reconhecer os receptores da célula hospedeira. A entrada na célula é mediada pela proteína S transmembrana que forma homotrímeros que se projetam para fora da superfície viral. A proteína S inclui duas subunidades funcionais, S1 e S2, sendo a primeira responsável pela ligação ao receptor da célula hospedeira e a segunda pela fusão das membranas viral e celular.

As proteínas S e N do coronavírus são componentes imunogênicos importantes, sendo produzidas em quantidades abundantes durante a infeção. A proteína S é o principal determinante de imunidade protetora e de transmissão dos coronavírus; os anticorpos monoclonais contra a proteína S podem neutralizar a infectividade viral14. Em um estudo comparativo13 de anticorpos contra o antígeno S1/S2 do teste Diasorin Liaison, com o teste de neutralização viral, foram obtidos índice de concordância com resultados positivos (PPA) de 94,4% e índice de concordância com resultados negativos (NPA) de 97,8%, confirmando que os anticorpos detectados por este determinado teste, que utiliza as proteínas S1/S2, apresentam função neutralizante contra o SARS-CoV-2. Apesar de dados que mostram que os anticorpos voltados à proteína N também podem ser neutralizantes, este teste, Liaison Diasorin, foi o primeiro a ter o efeito neutralizante bem documento.

Após a validação dos novos testes sorológicos, modificamos o protocolo de realização dos testes para a pesquisa de anticorpos contra o SARS-CoV-2, passando a usar 3 metodologias em paralelo para a confirmação de resultados (Snibe, Roche e Diasorin) e consequentemente, detectando anticorpos tanto para a proteína N quanto para a proteína S, conforme recomendação para se obter maior grau de sensibilidade e de especificidade.

 

Resumos dos testes disponíveis para o diagnóstico laboratorial de Covid-19 disponíveis no Richet:

1. RT-PCR utilizando teste Allplex Seegene (Coreia do Sul), usando como alvo três regiões gênicas, E, RdRp e N. - Resultados em 2 dias úteis (incluindo sábado). - Raspado de Nasofaringe.

2. RT-PCR teste rápido Xpert Xpress GeneXpert Cepheid (EUA) - Resultados em até 24h da realização do exame.. Caso o pedido esteja com descrição do exame incompleta, será feito o PCR normal e não o Xpress, que o resultado será de acordo com o exame realizado.

3. Pesquisa de Anticorpos IgM e IgG para SARS-CoV-2 usando 3 metodologias (Cobas Roche, Liaison Diasorin e Snibe) - Resultado em 2 dias úteis.

4. Pesquisa de Anticorpos IgG Neutralizantes (Liaison Diasorin) para SARS-CoV-2 - Resultado em 2 dias úteis.

 

Referências bibliográficas:

1. Wan, W, Xu, Y, Gao R, Lu R, Han K, Wu G, Tan W, Research Letter, JAMA on line, 11 March 2020 https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2762997

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13. Bonelli F, Sarasini A, Zierolda C, Calleria M, Bonettib A, Vismarad C, Blockia F, Pallavicinia L, Chinali A, Campisid D, Percivalleb E, DiNapolib AP, Pernod CF, Baldantib F, Clinical And Analytical Performance Of An Automated Serological Test That 2 Identifies S1/S2 Neutralizing IgG In Covid-19 Patients Semiquantitatively, bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.19.105445

14. Liaison SARS-CoV-2 S1/S2 IgG package insert revisão 04 – 2020-0

 

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Autor

Dr. Helio Magarinos

Diretor Médico      CRM 52.47173-0

Diretor do Richet Medicina & Diagnóstico, Helio Magarinos Torres Filho é Médico formado pela Universidade Federal Fluminense, especializado em Patologia Clínica e Medicina Laboratorial e possui MBA em Gestão de Negócios pelo IBMEC. Helio Magarinos também é Membro da Sociedade Brasileira de Patologia Clinica (SBPC), da American Association for Clinical Chemistry (AACC), da American Society for Microbiology (ASM), da American Molecular Pathology (AMP) e da European Society for Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID).